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    拉曼光譜法 中國藥典2020版四部通則0421

    中國藥典2020版四部通則0421

    拉曼光譜法


      拉曼光譜法研究化合物分子受光照射后所產生的非彈性散射,散射光與入射光能級差及化合物振動頻率、轉動頻率間關系。與紅外光譜類似,拉曼光譜是一種振動光譜技術。所不同的是,前者與分子振動時偶極矩變化相關,而拉曼效應則是分子極化率改變的結果。

      拉曼光譜采用激光作為單色光源,將樣品分子激發到某一虛態,隨后受激分子弛豫躍遷到一個與基態不同的振動能級,此時,散射輻射的頻率將與入射頻率不同。這種“非彈性散射”光被稱之為拉曼散射,頻率之差即為拉曼位移(以 cm-1 單位),實際上等于激發光的波數減去散射輻射的波數,與基態和終態的振動能級差相當。頻率不變的散射稱為彈性散射,即瑞利散射。如果產生的拉曼散射頻率低于入射頻率,則稱之為斯托克斯散射。反之,則稱之為反斯托克斯散射。實際上,幾乎所有的拉曼分析都是測量斯托克斯散射。

      用拉曼散射信號強度對拉曼位移作圖得到拉曼光譜圖。由于化合物的官能團或化學鍵的拉曼位移與它們在紅外光譜中的吸收波數相一致,所以拉曼譜圖的解析也與紅外吸收光譜相似。然而,通常在拉曼光譜中出現的強譜帶在紅外光譜中卻成為弱譜帶甚至不出現,反之亦然。所以,這兩種光譜技術;檠a充。

      和紅外光譜一樣,拉曼光譜記錄的光譜范圍通常在 400~4000cm-1 間,然而,用于不同目的的拉曼光譜儀設定的光譜范圍稍有不同,多數臺式拉曼光譜儀可采集頻率低至 100~200cm-1 的光譜,特殊設計的拉曼光譜儀的光譜范圍低至太赫茲光區(約 5~100cm-1)。對于大多數常規分析而言,頻率在 100cm-1 以上拉曼光譜足以提供充分的信息用于定性、鑒別和表征。然而,頻率在 100cm-1 以下仍有一些對完整表征樣品非常有意義的特征光譜,在某些情況下,這些低波數特征拉曼光譜是鑒別化合物或晶型的不可或缺的重要信息之一。

      拉曼光譜的優點在于它的快速、準確,測量時通常不破壞樣品,樣品制備簡單甚至不需樣品制備。譜帶信號通常處在可見或近紅外光范圍,可以有效地和光纖聯用;這也意味著譜帶信號可以從包封在任何對激光透明的介質(如玻璃、石英或塑料)中或將樣品溶于水中獲得。拉曼光譜能夠單機、聯機、現場或在線用于過程分析,當使用長距離光纖,適用于遠距離檢測,F代拉曼光譜儀使用簡單,分析速度快(幾秒到幾分鐘),性能可靠。因此,拉曼光譜與其他分析技術聯用比其他光譜聯用技術從某種意義上說更加簡便(可以使用單變量和多變量方法以及校準)。

      拉曼光譜既適合于化學鑒別、結構分析和固體性質如晶型轉變的快速和非破壞性檢測,也能夠用于假藥檢測和質量控制,例如:

      化學分析:原料藥活性成分、輔料等的鑒別和定量;

      物理分析:固態(如多晶、水合物和溶劑化物)和晶型的鑒別和定量;

      過程分析:生物和化學反應,合成、結晶、制粒、混合、干燥、凍干、壓片、裝填膠囊和包衣。

      拉曼光譜包含許多方法,如背散射拉曼光譜、透射拉曼光譜(TRS)、共振(RR)拉曼光譜、表面增強拉曼光譜(SERS)、針尖增強拉曼光譜(TERS)、空間位移拉曼光譜(SORS)、拉曼光活性(ROA)、相關-反斯托克斯拉曼光譜(CARS)、受激拉曼光譜(SRS)、共聚焦(CF)拉曼光譜和拉曼成像技術。

      一、定性鑒別和含量測定

      1.定性鑒別

      拉曼光譜可提供樣品分子中官能團的信息,所以可用于鑒別試驗和結構解析。在相同的測定條件下,繪制供試品與對照品的拉曼光譜并進行比對,若相同,除立體異構體外,即可鑒別為同一化合物。如遇多晶現象,可參照紅外鑒別的相關內容進行處理。

      2.含量測定

      對于配置測量光學功率檢測器的儀器(如 FT-拉曼儀),拉曼峰信號強度與分析物濃度有如下定量關系。

      Sν=κσv(νL-νβ)4P0C

      式中 Sν 為給定的波數 ν 處的拉曼信號強度;

      C 是分析物的濃度;

      κ 是與激光束直徑、采集光路、樣品體積和溫度有關的常數;

      σv 為特定振動模式的拉曼散射截面;

      νL 為激光波數;

      νβ 為振動模式的波數;

      P0 為激光功率。

      拉曼散射截面 σv 是特定振動模式的表征。

      對于測量每秒光子數(如帶 CCD 檢測器)的拉曼光譜儀,拉曼峰信號強度與分析物濃度有如下定量關系。

      Sν=κσvνL(νL-νβ)3P0C

      上述公式,都表明峰信號強度與濃度呈正比關系,是拉曼光譜定量測定的基礎。

      實際工作中,光路長度被更準確地描述為樣品體積,這是一種描述激光聚焦和采集光學的儀器變量。

      定量測定時,要求對照品和供試品在同一激光強度和頻率下,同一物理狀態(如液態、固態),且在同一濃度范圍測量。對于固體和懸浮物,拉曼信號強度受基質影響(如熒光和自吸收)。拉曼信號強度還與物質折射率、粒徑及其分布(小顆粒拉曼散射比大顆粒強)、填充強度、散射截面和吸收截面等有關。

      3.影響定量測定的因素

      最主要的干擾因素是熒光、樣品的熱效應和基質或樣品自身的吸收。在拉曼光譜中,熒光干擾表現為一個典型的傾斜寬背景。因此,熒光對定量的影響主要為基線的偏離和信噪比的下降,熒光的波長和強度取決于熒光物質的種類和濃度。與拉曼散射相比,熒光通常是一種量子效率更高的過程,甚至很少量熒光物質的熒光也可以導致顯著的拉曼響應信噪比降低。使用更長的波長例如 785nm、830nm 或 1064nm 的激發光可使熒光顯著減弱。然而,拉曼信號的強度與 λ-4 成比例,λ 是激發波長。通過平衡熒光干擾、信號強度和檢測器響應可獲得最佳信噪比。

      測量前將樣品用激光照射一定時間,固態物質的熒光也可得以減弱。這個過程被稱為光致漂白,是通過降解高吸收物質來實現的。光致漂白作用在液體中并不明顯,可能是由于液體樣品流動性,或熒光物質不是痕量。

      激光對樣品的加熱效應會造成一系列的問題,例如物理狀態的改變(熔化),晶型的轉變或樣品的燒灼,這是有色的、具強吸收或低熱傳導的小顆粒物質常出現的問題。激光對樣品加熱的影響通常是可觀察的,表現在一定時間內拉曼光譜或樣品的表觀變化。除了減少激光通量,有許多種方法可用來降低熱效應,例如在測量過程中移動樣品或激光,或者通過熱接觸或液體浸入或大光斑設計等來改善樣品的熱傳導。

      基質或樣品本身也可吸收拉曼信號。在長波傅里葉變換拉曼系統中,拉曼信號可以與近紅外的泛頻吸收重疊。這種影響與儀器的光學系統以及樣品的形態有關。樣品的裝填和顆粒大小的差異而引起的固體散射的可變性與這種效應有關。然而,由于在拉曼光譜中樣品的有限穿透深度和相對狹窄的波長范圍,所有這些效應的大小都沒有近紅外光譜嚴重。

      拉曼光譜是單光束零背景測量的光譜技術,樣品濃度的微小變化會導致拉曼信號水平比例的變化。所以,絕對的拉曼信號強度很難直接用于待測物的定量。其他變異的潛在來源是樣品的不透明性和樣品的不均勻性、照射樣品的激光功率的變化以及光學幾何學或樣品位置的變化。這些影響可以通過重現的或有代表性的樣品測量方式,以及使用設計合理的儀器予以減小,但是并不能完全消除。

      由于拉曼信號絕對強度的波動,應盡可能地使用內標?梢杂心康牡丶尤胍环N內標,該內標應具有與待測物互不干擾的特征譜帶以便檢測。在溶液中,也可利用溶劑的特征譜帶,因為溶劑隨樣品不同將相對保持不變。另外,在制劑中,如果賦形劑量大大超過待測組分,則可以使用該賦形劑的峰。在假設激光和樣品定位的改變將會同等地影響全光譜的前提下,全光譜同樣可以用作參比。在滿足測定的準確度和精密度要求時,也可以不使用內標。

      樣品測定中需考慮的重要因素還有光譜的污染。拉曼是一種可以被許多外源影響掩蔽的弱效應。普通的污染源包括樣品支持物(容器或基質)和周圍光線。通常,這些問題可以通過細致的實驗方法來識別和解決。

      二、儀器裝置

      根據獲得光譜的方式,拉曼光譜儀可分為色散型和傅里葉變換(FT)型,根據使用需求不同,還可將拉曼光譜儀分為實驗用臺式(包括配置顯微鏡)儀器和適合現場檢測的便攜式、手持式儀器。但所有的現代拉曼光譜儀均包括激光光源、樣品裝置、濾光器、單色器(或干涉儀)和檢測器等。

     。1)激光光源  下表列出了在藥學應用中使用的幾種激光。

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     。2)樣品裝置  可有各種各樣的樣品放置方式,包括直接的光學界面,顯微鏡,不接觸光纖探針(或光學浸入)和樣品室(包括特殊的樣品盛器和自動樣品轉換器)。樣品光路也可設計成能獲得偏振相關拉曼光譜,這種光譜通常包含附加信息。樣品裝置的選擇應根據待測物的具體情況(如樣品的狀態、體積等)以及測量的速度,激光的安全性和樣品圖譜的質量要求等決定。

     。3)濾光裝置  激光波長的散射光(瑞利光)要比拉曼信號強幾個數量級,必須在進入檢測器前濾除。普遍采用的是陷波濾波器,它具有濾波效果好和體積小等優點。另外,為防止樣品不被外輻射源(如房間燈光、激光等離子體)照射,需要設置適宜的濾波器或者物理屏障。

     。4)光波處理裝置  拉曼信號可通過光柵色散或者邁克爾遜干涉儀(傅里葉變換)來處理。任何合格儀器都適用于定性鑒別。然而,選擇定量測定用儀器時,應注意色散和動態線性響應可能在整個波譜范圍內并不均衡(例如當使用階梯光柵分光鏡時)。

     。5)檢測器  硅質電荷耦合探測器(CCD)是色散型儀器中最常用的檢測器。這種冷卻的陣列型檢測器允許在低噪聲下快速全光譜掃描,常與通常使用的 785nm 和 830nm 二極管激光器配合使用。傅里葉變換儀器通常采用單通道鍺或銦-鎵-砷化合物(In Ga As)檢測器以配合釹:釔-鋁-石榴紅(Nd:YAG)1064nm 的激光器在近紅外區使用。

      三、儀器校正

      拉曼儀器的校準包括三個要素:初始波長(X 軸)、激光波長以及強度(Y 軸)。

      儀器供應商應提供用戶可以執行的對儀器相關參數校準的方法。除另有規定外,使用者應根據儀器所提供的校準方法制定具體的 SOP,并嚴格按照 SOP 對上述參數進行驗證。

      特別需要注意的是,激光波長變化可影響儀器的波長精度和光度(強度)精度。即使是最穩定的激光器,在使用過程中其輸出波長也會有輕微變化。所以,激光波長必須經校正以確保拉曼位移的準確性?梢允褂脙x器供應商提供的拉曼位移標準參考物質進行定期校正。某些儀器可以用一種拉曼內標物與初級光路分離,外在校準裝置通過散射輻射準確地重現這一光路。

      推薦使用外部參考標準對儀器進行校正。

      對不同光譜分辨率的拉曼光譜儀,其波數精度應與樣品釆集所需的光學分辨率相適應,臺式、便攜式和手持式儀器可有不同的波數精度要求。所有用于拉曼測量的光譜儀都應確認拉曼位移的準確性。

      四、方法驗證

      必須對方法進行驗證,至少應考察準確度、精密度等主要指標。但這些指標受諸多可變因素的影響,其中熒光可能是影響方法適用性的主要因素。樣品中熒光雜質的存在完全隨樣品而異。所以,方法必須能適應不同的樣品體系,必須足以將雜質的影響降到最小。

      檢測器的線性必須適應可能的信號水平范圍。熒光可能使信號基線比驗證時高,這時必須設法將熒光減弱或者使驗證的方法適應較高的熒光水平。這一要求對方法的精密度、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)同樣適用,因為基線噪聲的增加會對這些數值產生影響。

      由于熒光使基線漂移可能同樣會影響定量,所以使用時,同樣需要在不同的光漂白作用水平進行可接受的定量驗證。

      必須確定激光是否對樣品造成影響。在不同激光功率和暴露時間的條件下,對樣品目視檢查和仔細審視測得的拉曼光譜可以確定樣品是否改變(而不是光漂白作用)。觀察的依據是譜帶位置、峰強和譜帶寬度是否改變或者背景強度是否有明顯變化。

      影響方法精密度的因素還包括樣品的位置和固體、液體樣品的形態,在校正模型中必須嚴密控制或說明。樣品的制備方法或樣品室的形狀可能影響測量靈敏度,而且,該靈敏度會隨著儀器的激發光和采集光學設置的不同而不同。

      五、測定法

      測定拉曼光譜可以采用以下任一物質態:結晶態、無定型態、液體、氣體或等離子體。

      液體能夠在玻璃或石英管(或池)中直接測量。無定型和微晶固體也可充填入玻璃或石英管中直接測定。為了獲得較大的拉曼散射光強度,通常使照射在樣品上的入射光與所檢測的拉曼散射光之間的夾角為0°、90°或180°。樣品池的放置可有多種方式。

      除另有規定外,一般用作鑒別的樣品不必制樣,用作晶型、異構體限度檢查或含量測定時,供試品的制備和具體測定方法可按正文中各品種項下有關規定操作。

      某些特殊樣品技術可被應用于表面增強拉曼光譜和顯微拉曼光譜測量。

      為防止樣品分解,常采用的辦法是旋轉技術。利用特殊的裝置使激光光束的焦點和樣品的表面做相對運動,從而避免了樣品的局部過熱現象。樣品旋轉技術除能防止樣品分解外,還能提高分析的靈敏度和樣品的均一性。

      常采用內標法定量,在激光照射下,加入的內標也產生拉曼光譜,選擇其一條拉曼譜帶作為標準,將樣品的拉曼譜帶強度與內標譜帶的強度進行比較(通常比較譜帶的面積或高度)。由于內標和樣品完全處于相同的實驗條件下,一些影響因素可以相互抵消。

      所選擇的內標應滿足以下要求:①化學性質比較穩定,不與樣品中被測成分或其他成分發生化學反應;②內標拉曼譜帶和待測物的拉曼譜帶互不干擾;③內標應比較純,不含有被測成分或其他干擾成分;對于水溶液,常用的內標是硝酸根離子(1050cm-1);對于非水溶液,可選擇環境和健康友好的物質成分作為內標;對于固體樣品,有時選擇樣品中某一拉曼譜帶作為自身對照內標譜帶。

      具有多晶現象的固體藥品,由于晶型不同,可能導致所收集的供試品光譜圖與對照品光譜圖或標準光譜集所收載的光譜圖不一致,遇此情況,應按該品種項下規定的方法進行預處理后再繪制比對。

      光譜的形狀與所用的儀器型號和性能、激發波長、樣品測定狀態及吸水程度等因素相關。因此,進行光譜比對時,應考慮各種因素可能造成的影響。


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