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    細菌DNA特征序列鑒定法 中國藥典2020版四部通則1021

    中國藥典2020版四部通則1021

    細菌DNA特征序列鑒定法


      細菌DNA特征序列鑒定法系以特征核酸序列作為目標檢測物,用于藥用原料、輔料、制藥用水、中間產品、終產品、包裝材料和環境等藥品全生命周期質量控制中細菌的鑒定。

      本法通過對細菌16S核糖體RNA(16S  ribosomal  RNA gene,16S  rRNA)基因特征序列的測定,實現細菌的生物學鑒定。細菌16S rRNA基因全長約1500bp,包含9個可變區(VarIable  region,V區)和10個恒定區(Constant  region,C區),在結構與功能上具有高度保守性,是細菌分類和鑒定中得到廣泛應用的DNA特征序列之一。

      

      實驗環境和儀器的一般要求

      

      開展細菌鑒定試驗的環境應具備分子生物學實驗室的基本條件,并符合相應級別的生物安全要求。

      所用儀器有電子天平、離心機、冰箱、恒溫儀、DNA定量儀器(如紫外或熒光分光光度儀),聚合酶鏈式反應(polymerase  chain  reaction,PCR)分析儀、電泳儀、凝膠成像儀、核酸測序儀等。

      

      試劑及其制備方法

      

      三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二鈉緩沖液(TE緩沖液,pH8.0)  稱取三羥甲基氨基甲烷12.1g,加適量水攪拌溶解,并稀釋至100ml,用鹽酸試液調節pH值至8.0,得到1mol/L貯備液;稱取乙二胺四乙酸二鈉18.6g,加適量水攪拌溶解,并稀釋至100ml,用氫氧化鈉試液調節pH值至8.0,得到0.5mol/L貯備液。取三羥甲基氨基甲烷貯備液10ml,乙二胺四乙酸二鈉貯備液2ml,加水稀釋至1000ml,滅菌。

      PCR反應緩沖液(pH8.3)  稱取三羥甲基氨基甲烷12.1g,氯化鉀37.3g,氯化鎂2.4g,加適量水攪拌溶解,并稀釋至1000ml,用鹽酸試液調節pH值至8.3,滅菌。

      電泳緩沖液(TAE緩沖液,pH8.0)  稱取三羥甲基氨基甲烷4.84g,冰乙酸1.14ml,乙二胺四乙酸二鈉0.75g,加適量水攪拌溶解,并稀釋至1000ml,用氫氧化鈉試液調節pH值至8.0。

      上樣緩沖液  稱取溴溴酚藍0.25g,二甲苯氰0.25g,蔗糖40.0g,加適量水攪拌溶解,并稀釋至100ml。

      核酸的提取、擴增、產物檢測和純化等也可以采用適宜的商品化試劑和試劑盒。

      

      方法適用性試驗

      

      細菌DNA特征序列鑒定時,應進行方法適用性試驗,以確認所采用的方法適合于目標菌的鑒定。若鑒定條件發生變化可能影響鑒定結果時,應重新進行方法適用性試驗。

      進行方法適用性試驗時,選擇革蘭陽性和陰性標準菌株按“待檢菌的測定”步驟進行操作。提取的核酸質量應能滿足核酸擴增的要求;核酸擴增產物應能在500bp左右檢測到一條目的條帶;核酸測序結果應與相應對照菌株的核酸序列一致。

      方法適用性試驗應設定陰性對照試驗,取滅菌的純化水作為陰性對照,照核酸提取及后續步驟進行操作。核酸擴增產物應無擴增條帶。

      方法適用性試驗可與待檢菌的測定同時進行。

      

      待檢菌的測定

      

      待檢菌的測定應設置陽性對照試驗和陰性對照試驗。

      陽性對照試驗

      根據待檢菌的革蘭染色等特性,選擇特征序列確定的菌株作為陽性對照菌,照待檢菌的測定步驟進行操作。陽性對照試驗提取的核酸質量應能滿足核酸擴增的要求;核酸擴增產物應能在500bp左右檢測到一條目的條帶;核酸測序結果應與相應對照菌株的核酸序列一致。

      陰性對照試驗

      取滅菌的純化水作為陰性對照,照核酸提取及后續步驟進行操作,用以確證核酸提取、PCR反應體系和擴增過程無污染。陰性對照試驗的核酸擴增產物應無擴增條帶。

      待檢菌測定

      (1)分離純化   挑取待檢菌在適宜的固體培養基上連續劃線培養,以獲取純培養物(單個菌落)。

      (2)核酸提取   核酸提取常用十六烷基三甲溴化銨(cetyltrimethylammonium  bromide  method,CTAB)法,也可采用十二烷基硫酸鈉法、堿裂解法等其他適宜的方法,必要時加入核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)去除RNA。

      CTAB法提取核酸的一般步驟   取適量經分離純化后的

      待測菌純培養物于離心管中,加入TE緩沖液450μl、溶菌酶(10mg/ml)25μl,混勻,置37℃水浴加熱30分鐘;加入10%十二烷基硫酸鈉溶液50μl,混勻,置37℃水浴加熱15分鐘;加入1%氯化鈉溶液80μl、10%CTAB溶液70μl,混勻,置65℃水浴加熱15分鐘;加入飽和苯酚-三氯甲烷-異戊醇(25:24:1,ml/m1)溶液350μl,劇烈振蕩,室溫靜置5分鐘,離心(轉速為每分鐘12000轉)10分鐘,取上清液置于新的離心管中,重復操作1次;加入2倍體積無水乙醇,于-20℃靜置不少于30分鐘,離心(轉速為每分鐘12000轉)10分鐘,棄去上清液;加入適量75%乙醇溶液洗滌,離心(轉速為每分鐘12000轉)10分鐘,棄去上清液,室溫風干至乙醇揮發完全;加入適宜體積的TE緩沖液溶解,作為核酸提取溶液(模板DNA),置2~8℃冰箱中備用。

      待檢菌提取的核酸質量應能滿足核酸擴增的要求,核酸濃度宜不低于10ng/μl。模板DNA濃度和純度測定常用紫外分光光度法,A260/A280比值宜在1.8~2.0之間。

      (3)核酸擴增  本法中的核酸擴增是指對16S rRNA基因VI~V3可變區核酸序列片段進行擴增,其擴增引物、反應體系及擴增程序如下:

      擴增引物  正向引物(16SV1F):5'-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3';

      反向引物(16SV3R):5'-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3'。

      反應體系  常用的PCR反應體系為25μl。制備時,取PCR反應緩沖液2.5μl,脫氧核糖核苷三磷酸(2.5mmol/L)2μl,正向和反向引物(2.5μmol/L)各2μl,模板DNA 1μl,Taq DNA聚合酶(1U/μl)1μl,加滅菌的純化水至25μl。

      擴增程序  采用的擴增程序為:94℃預變性3分鐘;94℃變性30秒,55~60℃退火30秒,72℃延伸60秒,30個循環;72℃繼續延伸5分鐘。

      (4)核酸擴増產物的檢測  采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測核酸擴增產物。使用電泳緩沖液配制1.5%瓊脂糖凝膠,其中加入溴化乙錠或吖啶橙等適宜的核酸凝膠染色劑。取核酸擴增產物5μl、上樣緩沖液1μl,混勻后上樣,于100~150V電壓下電泳,溴酚藍條帶移動至凝膠片的1/2~2/3處結束電泳。取凝膠片在紫外凝膠成像儀上檢視,核酸擴增產物應在約500bp的位置出現一條目的條帶。核酸擴增產物檢測時應選擇適宜的DNA分子量標記,目的條帶的大小應包括在DNA分子量標記的范圍內。

      (5)核酸擴增產物的純化  核酸擴增產物應進行純化,去除擴增引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶等殘留。核酸擴增產物純化的主要步驟包括:將瓊脂糖凝膠中的核酸擴增產物切下,置于離心管中,加入適量體積的TE緩沖液,65~95℃水浴至凝膠塊完全溶解;分別加入1/10體積乙酸鈉溶液(3mol/L,pH5.2)和乙二胺四乙酸鈉溶液(125mmol/L,pH8.0),混勻;加入2倍體積無水乙醇,-20℃靜置30分鐘;離心(轉速為每分鐘12000轉)10分鐘,棄去上清液;加入適量75%乙醇溶液洗滌,離心(轉速為每分鐘12000轉)10分鐘,棄去上清液,室溫風干至乙醇揮發完全;加入適宜體積的TE緩沖溶液溶解,作為核酸擴增產物的純化溶液,置2~8℃冰箱中備用。

      (6)核酸測序 以擴增引物作為測序引物,使用核酸測序儀對純化后的核酸擴增產物進行雙向測序,獲得目標核酸序列。對核酸測序結果進行序列質量核查。雙向測序峰圖應采用有峰圖拼接功能的軟件,以正、反向核酸序列疊加的方式進行序列拼接,并去除兩端引物區序列。拼接后得到的核酸序列方向應與核酸擴增正向引物方向一致。

      (7)結果判定  將獲得的細菌DNA特征序列與經驗證過的專用數據庫進行比對。根據比對結果進行判定。


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