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  • 首頁 >> 行業動態 >>國家標準 >>中國藥典2020版質量標準 >> 人胰島素(Ins) 質量標準 中國藥典2020版
    详细内容

    人胰島素

    Ren Yidaosu

    Human Insulin

    image.png

      分子式:C257H383N65O77S6分子量:5807.69Da

      本品系由含有可高效表達人胰島素基因的工程化細胞,經發酵、分離、高度純化、結晶和干燥制成的原料藥。人胰島素為51個氨基酸殘基組成的蛋白質。按干燥品計算,含人胰島素(包括A21脫氨人胰島素)應為95.0%~105.0%。

      每1單位人胰島素相當于0.0347mg。

      1  基本要求

      生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具等應符合“凡例”的有關要求。

      2  制造

      2.1  工程菌

      工程菌菌種名稱、來源及種子批檢定應符合批準的要求。

      2.2  原料

      2.2.1  種子液制備

      將檢定合格的工作種子批細胞接種于適宜的培養基(可含適量抗生素)中培養。

      2.2.2  發酵用培養基

      采用適宜的不含抗生素的培養基。

      2.2.3  種子液接種及發酵培養

      2.2.3.1  在滅菌培養基中接種適量種子液。

      2.2.3.2  應根據經批準的工藝進行發酵,并確定相應的發酵條件,如溫度、pH值、溶解氧、補料、發酵時間等。如系大腸埃希菌表達,發酵液應定期進行質粒丟失率檢查(通則3406)。

      2.2.4  發酵液處理

      用適宜的方法收集、處理細胞。

      2.2.5  初步純化及高度純化

      釆用經批準的純化工藝進行初步純化和高度純化,使其純度達到規定的要求。

      2.2.6  過濾、結晶及干燥

      經初步純化和高度純化后,釆用經批準的結晶工藝及干燥工藝對純化收集物進行過濾、結晶和干燥,干燥品即為人胰島素原料藥。

      2.2.7  分批

      應符合“生物制品分包裝及貯運管理”規定。

      2.2.8  包裝

      應符合“生物制品分包裝及貯運管理”規定和批準的內容。

      3  檢定

      3.1  性狀

      本品為白色或類白色粉末。

      3.2  鑒別

      3.2.1  在含量測定項下記錄的色譜圖中,供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。

      3.2.2  取本品適量,用0.1%三氟乙酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液,取20μl,加0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH7.3)20μl、0.1%V8酶溶液20μl與水140μl,混勻,置37℃水浴中2小時后,加磷酸3μl,作為供試品溶液;另取人胰島素對照品適量,同法制備,作為對照品溶液。照含量測定項下的色譜條件,以0.2mol/L硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(90∶10)為流動相A、乙腈-水(50∶50)為流動相B,按下表進行梯度洗脫。取對照品溶液和供試品溶液各25μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,片段Ⅱ與片段Ⅲ之間的分離度應不小于3.4,片段Ⅱ與片段Ⅲ的拖尾因子應不大于1.5。供試品溶液的肽圖譜應與對照品溶液的肽圖譜一致。

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      3.3  檢查

      3.3.1  有關物質

      取本品適量,用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中含3.5mg的溶液,作為供試品溶液。照含量測定項下的方法,以0.2mol/L硫酸鹽緩沖液(pH2.3)-乙腈(82∶18)為流動相A、乙腈-水(50∶50)為流動相B,按下表進行梯度洗脫。調節流動相比例使人胰島素主峰的保留時間約為25分鐘,系統適用性試驗應符合含量測定項下的規定。取供試品溶液20μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按峰面積歸一化法計算,A21脫氨人胰島素不得過1.5%;其他雜質峰面積之和不得過2.0%。

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      3.3.2  高分子蛋白質

      取本品適量,用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中約含4mg的溶液,作為供試品溶液。照分子排阻色譜法(通則0514)試驗。以親水改性硅膠為填充劑(5~10μm);以冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液(15∶20∶65)為流動相,流速為每分鐘0.5ml,檢測波長為276nm。取人胰島素單體-二聚體對照品,用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中含4mg的溶液;取100μl注入液相色譜儀,人胰島素單體峰與二聚體峰的分離度應符合要求。取供試品溶液100μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,除去保留時間大于人胰島素主峰的其他峰面積;按峰面積歸一化法計算,保留時間小于人胰島素主峰的所有峰面積之和不得大于1.0%。

      3.3.3  鋅

      精密稱取本品適量,加0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.1mg的溶液。另精密量取鋅單元素標準溶液(每1ml中含鋅1000μg)適量,用0.01mol/L的鹽酸溶液分別定量稀釋成每1ml含鋅0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg及1.0μg的鋅標準溶液,照原子吸收分光光度法(通則0406第一法),在213.9nm的波長處分別測定吸光度,按干燥品計,含鋅量不得大于1.0%。

      3.3.4  干燥失重

      取本品0.2g,在105℃干燥至恒重,減失重量不得過10.0%(通則0831)。

      3.3.5  熾灼殘渣

      取本品約0.2g,依法檢查(通則0841),遺留殘渣不得過2.0%。

      3.3.6  微生物限度

      取本品0.3g,照非無菌產品微生物限度檢查:微生物計數法(通則1105),每1g供試品中需氧菌總數不得過300cfu。

      3.3.7  細菌內毒素

      取本品,依法檢查(通則1143),每1mg人胰島素中含內毒素的量應小于10EU。

      3.3.8  宿主蛋白殘留量

      取本品適量,依法檢查(通則3412或3414),或釆用經驗證并批準的適宜方法檢查,每1mg人胰島素中宿主蛋白殘留量不得過10ng。

      3.3.9  宿主DNA殘留量

      取本品適量,依法檢查(通則3407),或采用經驗證并批準的適宜方法檢查,每1.5mg人胰島素中宿主DNA殘留量不得過10ng。

      3.3.10  抗生素殘留量

      如生產(例如種子液制備)中使用抗生素,應依法檢查(通則3408),或釆用經批準的方法檢查,不應有殘余氨芐西林或其他抗生素活性。

      3.3.11  生物學活性(至少每年測定一次)

      取本品適量,照胰島素生物測定法(通則1211),每組的實驗動物數可減半,實驗釆用隨機設計,照生物檢定統計法(通則1431)中量反應平行線測定隨機設計法計算效價,每1mg人胰島素的效價不得少于15單位。

      3.3.12  N末端氨基酸序列(至少每年測定一次)

      取本品,采用氨基酸序列分析儀或其他適宜的方法測定。

      A鏈N末端15個氨基酸序列:

      Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln;

      B鏈N末端15個氨基酸序列:

      Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu。

      3.3.13  單鏈前體

      工藝中如有單鏈前體,應采用經批準的方法及限度進行控制。

      3.4  含量測定

      照高效液相色譜法(通則0512)測定。

      色譜條件與系統適用性試驗  用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(5~10μm),0.2mol/L硫酸鹽緩沖液(取無水硫酸鈉28.4g,加水溶解后,加磷酸2.7ml、水800ml,用乙醇胺調節pH值至2.3,加水至1000ml)-乙腈(74∶26,或適宜比例)為流動相;流速為1.0ml/min;柱溫40℃;檢測波長為214nm。取系統適用性試驗用溶液(取人胰島素對照品,用0.01mol/L鹽酸溶液制成每1ml中含1mg的溶液,室溫放置至少24小時)20μl,注入液相色譜儀,人胰島素峰和A21脫氨人胰島素峰(與人胰島素峰的相對保留時間約為1.3)的分離度不小于1.8、拖尾因子不大于1.8。

      測定法  取本品適量,精密稱定,用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋至每1ml中約含0.35mg(約10單位)的溶液(臨用新配)。精密量取20μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖;另取人胰島素對照品適量,同法測定。按外標法以人胰島素峰與A21脫氨人胰島素峰面積之和計算,即得。

      4  保存、運輸及有效期

      避光,密閉,在-15℃及以下保存和運輸。自生產之日起,按批準的有效期執行。


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